نمایش افتراقی RT- PCR

روش نمایش افتراقی RT-PCR، روشی از غربالگری افتراقی می باشد که برای شناسایی mRNA خاص به کار می رود. که شامل سه مرحله عمده می باشد:

1- رونویسی معکوس از mRNA ها که از روی آن cDNA تک رشته ای ساخته می شود. 

2- تکثیر cDNA به روش PCR.

3- جداسازی الکتروفوروزی قطعات cNDA دورشته ای پیش از کلونینگ آنها. 

این سه مرحله به طور همزمان انجام شده و به موازات جداسازی mRNA از بافت های مختلف یا تیمار آنها می باشد. ژل های الکتروفروز را میتوان با باندهای شناسایی شده cDNA که به طریق افتراقی تمایز یافته اند مقایسه کرد. 

رونویسی معکوس:

پس از استخراج RNA تام و تا حد امکان انتخاب mRNA که دارای دم پلی A می باشد، مرحله اول سنتز cDNA تک رشته ای می باشد. فرایند رونویسی معکوس با استفاده از پرایمر های T₁₂XY انجام می شود که مکمل دم پلی A  می باشد. X می تواند مطابق با هر بازی بجز تیمیدین و Y می تواند هر نوع بازی باشد. بنابراین 12 ترکیب ممکن برای پرایمر های T₁₂XY  وجود دارد که همه آنها مکمل خانواده mRNA متفاوتی می باشد. برای مثال، پرایمر T₁₂AC مکمل تمام mRNA هایی می باشد که انتهای آنها GUA₁₂ می باشد. در صورتی که پرایمر T₁₂AG مکمل همه ی mRNA هایی می باشد که انتهای آنها CUA₁₂ می باشد و انتخاب پرایمر ها تعیین کننده نوع mRNA مورد مطالعه می باشد. این روش غربالگری برای تفکیک روی ژل الکتروفورز لازم می باشد، اگر هیچ غربالگری استفاده نشود استفاده از پرایمر T₁₂ که مکمل همه mRNA ها می باشد میزان cDNA محصول بسیار زیاد می دهد و تفکیک روی ژل الکتروفروز بسیار پایین می باشد. بنابراین، باند های زیادی مشاهده میگردد. این مرحله غربالگری منجر به انتخاب جمعیت mRNA متوسط 12 جمعیت mRNA موجود در سلول را مورد مطالعه قرار می دهد. هنگامی که پرایمر ها انتخاب شدند، استفاده از آنها منجر به انتخاب یک mRNA از میان mRNA های استخراج شده از بافت های مختلف می گردد. 

تکثیر cDNA - تک رشته ای به روش PCR:

در طی این مرحله cDNA به دست آمده از واکنش رونویسی معکوس به وسیله PCR تکثیر می گردد. واکنش تکثیر نیاز به دو پرایمر دارد; یکی از پرایمر ها مکمل انتهای3'-OH مولکول cDNA می باشد که پرایمر T₁₂XY   مورد استفاده برای رونویسی معکوس و پرایمر دومی مکمل انتهای 5'- فسفات cDNA می باشد. که مطابق با پرایمر تصادفی 10 جفت بازی می باشد. پرایمر تصادفی در جایگاه تصادفی در 5'- فسفات در ارتباط با دم پلیA هیبرید می شود که این واکنش منجر به ایجاد cDNA دورشته ای جرئی با اندازه های مختلف می گردد که بخش 3'-OH مولکول mRNA مورد نظر را احاطه می کند. 

جداسازی الکتروفورزی و کلونینگ cDNA:

cDNA دورشته ای که در مرحله تکثیر PCR ایجاد میگردد به وسیله الکتروفورز روی ژل اکریل آمید مشابه با ژل هایی که برای توالی یابی مورد استفاده قرار می گیرند از هم جدا می شوند. این ژلها عمدتا برای جداسازی قطعات کمتر از 500 جفت باز مورد استفاده قرار می گیرند. محصولات مختلف به وسیله اتورادیوگرافی قابل مشاهده می شوند (اگر مراحل در حضور dATP های (S³⁵) انجام گیرد. یا به وسیله نقره رنگ آمیزی گردند. نمونه های مختلف را به وسیله یک ژل مقایسه مینمایند. اگر میزان mRNAای که به وسیله تیمار های مختلف در روش تکراری (Reproducible) حاصل شده را میتوان باندهای مختلف را از روی ژل جدا نمود که این عمل را میتوان مستقیما هنگامی که ژل را به وسیله نقره رنگ آمیزی می شود، انجام داد. 

بر عکس، در نشاندار کردن رادیواکتیو، اتورادیوگرام ژل باید برای مشخص کردن ناحیه دارای باند cDNA هدف روی آن قرار گیرد. مقدار cDNA موجود در باند کمتر از میزانی می باشدکه بتوان مستقیما ساب کلون کرد در مرحله اول، باید DNA موجود در قطعه جداشده را با استفاده از جفت پرایمر اولی دوباره تکثیر کرد، سپس قطعه جدید تکثیر شده را در پلاسمید ساب کلون کرده، و در نهایت توالی یابی نمود. پروبی که در نتیجه توالی یابی حاصل می شود را میتوان برای مطالعات دقیق تر بیان ژن، غربالگری کتابخانه cDNA (به منظور به دست اوردن طول کامل cDNA)، کتابخانه ژنی، لکه گذاری نودرن و هیبریداسیون درجا و غیره مورد ارزیابی قرار داد. 

روش نمایش افتراقی RT- PCR مزایایی دارد که از جمله انها:

1- به دلیل استفاده از PCR این روش به مقدار کمی از مواد نیاز دارد: 1µg از RNA پلی A برای 150 واکنش استفاده میگردد.

2- ژن هایی با بیان بالا و بیان پایین را میتوان روی یک ژل شناسایی نمود. (مشاهده یا عدم مشاهده باند). 

3- این روش بسیار سریعتر از روش های متداول غربالگری افتراقی میباشد. و نمایش افتراقی RT- PCR را میتوان برای جداسازی و شناسایی کلون cDNA در 15 روز مورد استفاده قرار داد.