مطالعه ژنومها(ترانسکریپتوم)

تغییر توجه از ژنهای منفرد به ژنوم منجر به انواع بررسیهایی شده است که هدف آنها فهم فعالیت کل ژنوم است.این کار منجر به ابداع دو اصطلاح جدید شده است:

ترانسکریپتوم که محتوای mRNA) RNA) یک سلول است و الگوی کلی بیان ژن در آن منعکس می گردد.

پروتئوم که محتوای پروتئین یک سلول است و قابلیت بیوشیمیایی سلول را منعکس می کند.

مطالعه ترانسکریپتوم: 

ترانسکریپتوم ترکیب پیچیده ای است که شامل صدها یا هزاران mRNA مختلف است که هر یک بخش متفاوتی از یک جمعیت کلی است. بنابراین برای شناسایی یک ترانسکریپتوم بایستی انواع mRNA آن و به طور ایده ال فراوانی آنها را تعیین نمود.

مطالعه یک ترانسکریپتوم با بررسی توالی:

مستقیم ترین راه برای شناسایی ترانسکریپتوم تبدیل mRNA آن به cDNA و سپی تعیین توالی هر کلون در کتابخانه cDNA حاصل است. مقایسه توالی های cDNA  و توالی ژنوم ماهیت ژنهایی که mRNA آنها در ترانسکریپتوم وجود دارد را مشخص خواهد کرد. این فرایند امکانپذیر اما پر زحمت است, زیرا توالیهای cDNA  زیادی نیازمند است تا یک تصویر نسبتا کامل از ترکیب ترانسکریپتوم بدست اید. آیا می توان راه کوتاهتری برای به دست آوردن سریع اطلاعات توالیها حیاتی پیمود؟

بررسی سریالی بیان ژن (Serial analysis of gene experession) یا SAGE یک راه حل ممکن است. SAGE  به جای مطالعه cDNA  کامل یک توالی کوتاه 12 جفت بازی را فراهم می کند که هر کدام نماینده یک mRNA در ترانسکریپتوم می باشد. اساس این روش همین توالیهای 12 جفت بازی است که با وجود اندازه کوچکشان برای شناسایی ژنهای رمز دهنده mRNA کافی هستند. اولین مرحله برای ایجاد توالیهای 12 جفت بازی, تثبیت mRNA درون یک ستون کروماتوگرافی با اتصال دم پلی A موجود در انتهای 3 مولکولها به ریزدانه های سلولزی است. mRNA به cDNA  دو رشته ای تبدیل شده و سپس با آنزیم محدود کننده دارای جایگاه شناسایی چهار تایی مانند AluI تیمار می شود تا cDNA  در جایگاههای زیادی بریده شود. قطعات محدود کننده انتهایی به ریزدانه های سلولزی متصل باقی می مانند و سایر قطعات را می توان شست و از ستون خارج نمود. حال یک اتصال دهنده کوتاه به انتهای آزاد هز cDNA متصل می گردد.این اتصال دهنده دارای جایگاه شناسایی آنزیم BsmEI است. این آنزیم یک آنزیم محدود کننده غیر طبیعی است که علاوه بر برش جایگاه شناسایی خود, در فاصله 10-14 نوکلوئوتید فرودست خود نیز برش ایجاد می کند. بنابراین تیمار با BsmEI  قطعاتی با میانگین طول 12 جفت باز را از انتهای هر cDNA جدا می کند. این قطعات جمع آوری شده و به صورت سر به دم به صورت یک زنجیر به هم متصل شده و تعیین توالی می گرددو توالیهای جداگانه در زنجیر قابل شناسایی هستند, زیرا با جایگاهای BsmEI  از هم جدا می شوند.

حامل های کلون سازی ژن

پلاسمیدها:

پلاسمید ها مولکول های حلقویDNA هستند که وجودی مستقل در سلول باکتریایی دارند. تقریبا همیشه پلاسمید ها یک یا چند ژن حمل می کنند که اغلب مسئول صفات مفیدی هستند که باکتری میبان از خود نشان می دهد. برای نونه توانایی زنده ماندن در غلظتهای سمی آنتی بیوتیکهایی مانند کلرامفنیکل یا آمپی سیلین به طور معمول ناشی از موجود یک پلاسمید حمل کننده ژنهای مقاومت در باکتری می باشد. در آزمایشگاه برای اطمینان از وجود یک پلاسمید ویژه در باکتری اغلب از مقاومت به آنتی بیوتیک به عنوان یک شاخص انتخابگر استفاده می شود. برای نمونه پلاسمید RP4 ژن های مقاومت با آمپی سیلین , تتراسیکلین و کانامایسین را حمل می کند.فقط سلول E.coli دارای پلاسمید RP4 (یا پلاسمید هم خانواده) قادر به بقا و رشد روی محیط دارای این آنتی بیوتیک ها در مقادیر سمی یا بیش از آن هستند. اغلب پلاسمید ها دست کم دارای یک توالی DNA هستند که می تواند به عنوان مبدا همانند سازی عمل کند تا پلاسمید بتواند کاملا مستقل از کروموزوم اصلی باکتری درون سلول تکثیر شود.پلاسمید های کوچک آنزیم های همانند سازی DNA سلول میزبان را برای ایجاد نسخه هایی از خود بکار می گیرند, در حالی که تعدادی از پلاسمید های بزرگتر حامل ژنهایی هستند که آنزیم های خاصی را برای همانند سازی پلاسمید رمزدهی می کنند. انواع معدودی از پلاسمید ها می توانند با وارد کردن خود به کروموزوم باکتری همانند سازی کنند. این پلاسمید ها داخل شونده یا اپیزوم ها ممکن است در تقسیمات متوالی سلول به طور پایدار به این شکل باقی بمانند, اما همیشه در مراحلی به صورت عناصر مستقل می توانند حضور داشته باشند.

اندازه و تعداد نسخه:

اندازه و تعداد نسخه یک پلاسمید هنگام کلون سازی اهمیت ویژه ای دارد. اندازه کمتر از 10 کیلو باز برای یک حامل کلون سازی مناسب است.دامنه اندازه پلاسمید ها یک کیلوباز برای کوچکترین تا 250 کیلو باز برای بزرگترین پلاسمید ها است. بنابراین فقط تعداد کمی از آنها برای اهداف کلون سازی مفیدند. تعداد نسخه به تعداد مولکول های یک پلاسمید منفرد که به طور طبیعی در یک سلول باکتری یافت می شود اطلاق می گردد. عوامل تعیین کننده تعداد نسخه پلاسمید به خوبی شناخته نشده اند.بعضی پلاسمید ها به ویژه پلاسمید های بزرگ Stringent هستند و دارای تعداد نسخه اندک حتی یک یا دو عدد در یک سلول می باشند. سایر پلاسمید ها که Relaxed نامیده می شوند, تا 50 عدد یا بیشتر در یک سلول وجود دارند. به طور کلی گفته می شود یک حامل کلون سازی مفید باید نسخه های زیادی داشته باشد تا بتوان مقدار زیادی مولکول DNA نوترکیب به دست آورد.

اندازه پلاسمید های نمونه:

                                                                   اندازه

پلاسمید          تعداد نوکلئوتید ها (Kd)           وزن مولکولی(MDa )                  موجود

                                2/1                                        1/8                              E.coli
  pUC8

                                6/4                                        4/2                              E.coli  
  CdE1           

                                54                                           36                           سودوموناس
  RP4

                                95                                           63                             E.coli               
   F

                               117                                           78                                       سودوموناس پوتیدا                                                  TOL

                               213                                        142                                آگروباکتریوم تیوم فاشینس
pTiAch5

گروه بندی یلاسمید ها:

مفید ترین گروه بندی پلاسمید های طبیعی بر اساس ویژگی اصلی است که توسط ژنهای پلاسمید رمزدهی می شود.پنج نوع اصلی پلاسمید ها بر اساس این گروه بندی به صورت زیر است:

پلاسمید های باروری یاF تنها ژنهایی Tra را حمل می کنند و هیچ ویژگی دیگری علاوه بر انتقال پلاسمید ها همراه با کونژوگه شدن را ندارند یک مثال شناخته شده پلاسمید f در E.coli است.

پلاسمید های مقاومت یا R ژنهایی را حمل میکنند که باکتری میزبان را در مقابل یک یا تعداد بیشتری عامل ضذ باکتریایی مثل کلرامفنیکل, آمپی سیلین و جیوه مقاوم می کنن. پلاسمید R در میکروب شناسی بالینی اهمیت زیادی دارند زیرا گسترش آنها در میان جمعیت های طبیعی می تواند عواقب خطرناکی در درمان عفونت های باکتریایی داشته باشد. مانند RP4 که به طور معمول در سودوموناس یافت می شود, اما در بسیاری باکتری های دیگر نیز وجود دارد.

پلاسمید Col که کلیسینها یعنی پروتئین هایی که باکتریهای دیگر را می کشند, را رمز دهی می کنند Co1E1  در E.coli.

پلاسمید های تخریبگر توانایی متابولیزه کردن مولکول های غیر معمول مثل تولوئن و اسید سالیسیلیک را به باکتری میزبان می دهد مانند پلاسمید TOL در سودوموناس پوتیدا.

پلاسمید های بیماری زا قدرت بیماری زایی را به باکتری میزبان می دهند, مانند پلاسمید Ti در آگروباکتریوم تیوم فاشینس که بیماری گال را در گیاهان دو لپه ای ایجاد می کند.

پلاسمید ها در موجوداتی غیر از باکتری ها:

اگرچه پلاسمید ها به طور گسترده در باکتری ها یافت می شود اما در موجودات دیگر تا این حد متداول نیستند. شناخته شده ترین پلاسمید یوکاریوتی حلقه دو میکرومتری است که در تعدادی از سویه های ساکرومیسس سروزیه وجود دارند. کشف پلاسمید دو میکرومتری خوش شانسی بزرگی بود , چرا که امکان ساخت حامل هایی برای کلون سازی ژنها توسط این موجودات بسیار مهم صنعتی را به عنوان میزبان فراهم اورد. به هر حال جستجوی پلاسمید ها در دیگر یوکاریوت ها(مانند قارچهای رشته ای, گیاهان و حیوانات)نا امید کننده بوده است و به نظر می رسد موجودات عالیتر به سادگی پلاسمید ها را در سلول های خود پناه نمی دهند.

آکروزوم

آکروزومی که در سر اسپرم وجود دارد از طریق هضم جداره تخمک باعث میشود تا اسپرم بتواند به درون تخمک نفوذ کرده و لقاح صورت پذیرد. آکروزوم در مهره داران به شکل کلاهک و در بی مهرگان درست بر روی رأس هسته قرار میگیرد. آکروزوم از دستگاه گلژی منشا میگیرد. در اسپرماتید جوان، دستگاه گلژی به صورت غشاءهای متحد المرکز در اطراف واکویل های کوچک قرار گرفته اند. یک یا چند واکویل با یکدیگر ترکیب شده ، واکویل بزرگتری میسازند و یک جسم فشرده به اسم «ذره ی پیش اکروزومی» یا «proacrosomal granule» را احاطه می کنند. واکویل و ذرات داخلش روی سطح نوک هسته ی اسپرم قرار می گیرند. سپس ذره ی داخلی بزرگتر شده و ذره ی آکروزومی را میسازد که هسته و مرکز آکروزوم را تشکیل میدهد. در مرحله بعد، واکویل مایع خود را از دست میدهد و دیواره اش ذره ی آکروزومی و نیمه قدامی هسته را می پوشاند. در نتیجه با دو لایه به اسم «کلاهک آکروزومی» ، نیمه ی قدامی اسپرم را احاطه می کند. باقیمانده ی دستگاه گلژی یا «golgi rest» و سیتوپلاسم اضافی «اسپرماتید» نیز تحلیل رفته و سپس کاملاً از بین میرود.

ادامه نوشته